AWSG爱保信(Biotech)-破解肿瘤基因治疗载体难题

来源:AWSG爱保信发布时间:2021-01-19 13:19:34

基因治疗是将人类的正常基因或有治疗作用的外源目的基因,通过一定的基因转运系统导人人体靶细胞或直接注入人体,表达具有功能的蛋白质,以达到补充、纠正基因的缺陷,从而达到治疗疾病的目的。自从1990年美国国立卫生研究院和其下属重组DNA顾问委员会批准了美国第一例临床基因治疗申请以来,基因治疗对象已从单基因遗传病扩展到多基因遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病以及艾滋病等感染性疾病。

目前,全球已有1 020种基因治疗方案用于临床,其中美国占66%。用于肿瘤治疗的有675种,显示肿瘤已经成为基因治疗的重要研究对象。近年来,随着对肿瘤发病的分子机制及细胞生长调控机制研究的深入,肿瘤的基因治疗研究取得了巨大进展,例如将抑癌基因、自杀基因和免疫调节基因等连接至载体转染肿瘤细胞,以抑制或消除肿瘤细胞。

肿瘤基因治疗的方法有直接体内疗法和间接体内疗法。前者是指将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体,直接导人体内;后者是指将治疗基因连接至载体并在体外导人受体细胞,筛选转化细胞扩增后回输体内。但无论是那种方法,其要素均为目的基因、载体和靶细胞,而构建安全、有效、可控的基因载体为基因治疗的瓶颈。随着人类基因组计划的初步完成,分子病毒学和材料学的发展,在原有以病毒载体为主的基础上,新型肿瘤基因治疗载体不断出现。

 

1 肿瘤基因治疗载体的种类与优缺点

 

肿瘤基因治疗的载体分为病毒性载体和非病毒性载体两大类。

 

1.1病毒性载体

病毒是天然的基因转运系统。病毒在感染宿主时,病毒的核酸能够进入哺乳动物细胞并在细胞内进行复制、转录和翻译,生成子代病毒。野生型病毒株可经过修饰去除致病基因而保留其感染和复制能力,构建能够携带外源目的基因的载体。病毒性载体有:反转录病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒相关病毒载体、痘病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、仙台病毒载体、脊髓灰质炎病毒载体和杂交病毒载体。目前临床试验中最常用的是反转录病毒载体,其次为腺病毒载体。

 

12非病毒性载体 非病毒性载体主要是针对病毒载体的缺点而研制的,近年来发展很快。常见的非病毒性载体有:真核细胞表达质粒载体、阳离子聚合物、阳离子脂质体、人工染色体、活菌载体和拟病毒颗粒。目前,临床试验中最常用的是真核细胞表达质粒载体,其次为阳离子脂质体。 



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肿瘤基因治疗载体在临床应用中存在的问题

 

肿瘤基因治疗研究已取得了许多令人瞩目的进展,已经成为世界上基因治疗研究者关注的焦点。在肿瘤基因治疗载体研究方面也有了很大的进步,原有的病毒性载体不断得到改进,而且开发出了一些新的病毒性载体和非病毒性载体。尽管如此,目前肿瘤基因治疗载体尚存在以下共同的问题。

 

2.1 外源目的基因整合入靶细胞染色体的整合率不高

外源目的基因通过载体介导,整合在靶细胞的染色体上,就能够随宿主细胞不断遗传,从而使目的基因得以长期表达,达到“一劳永逸”的治疗效果。但是,目前的载体中,只有反转录病毒载体、腺病毒相关病毒载体、慢病毒载体能够整合至宿主细胞基因组中,其他病毒性载体和非病毒性载体则不能整合。能够整合的病毒载体虽然可以使目的基因长时期地存

在和表达,但其随机的整合有可能引起人体插入部位固有基因的突变,有可能诱发肿瘤和某些基因功能的丧失。

 

2.2 遗传不稳定

大部分病毒性载体如腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘病毒载体等,以及非病毒性载体不能够整合至细胞染色体上,而是以附加体的形式独立存在于细胞核,并不会随细胞分裂而遗传,当细胞脱离分裂周期后,目的基因则无法表达。因此,外源基因不能稳定地遗传,造成治疗效果不稳定。

 

2.3携带外源基因的容量较小

目前所用的病毒性载体中,单纯疱疹病毒载体和痘病毒的基因组较大,可以将较大的外源目的基因插入,所以载体容量也较大,分别为40 kb和25 kb。而非病毒性载体的插入外源目的基因的片段大小也受到限制。在基因治疗的实践中,常常需要使用较大容量的载体,以便能允许同时插入多个外源基因,从而达到联合治疗的目的。Moriuchi等口41将单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因和()嘧啶脱氨激酶两个自杀基因同时插入单纯疱疹病毒基因组中,应用于脑部肿瘤的基因治疗获得成功。但是,目前绝大多数基因治疗载体的容量都比较小,在实际应用时受到限制。

 

2.4宿主范围有限

病毒性载体转导的宿主细胞因病毒本身的特点而不同。如反转录病毒载体只转染分裂细胞Els-163,此特点可使肿瘤细胞成为天然的靶细胞。但是,也有一些瘤细胞总是处于静止期而逃避基因治疗。而腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒则既可转染分裂细胞又可转染非分裂细胞。载体来源病毒的种属对可转染的宿主细胞也有选择性。非病毒性载体则对宿主的选择性不强,但其转染效率通常较低。

 

2.5宿主细胞靶向特异性低 

目前所使用的基因治疗载体,无论是病毒性载体还是非病毒性载体,靶向特异性都较低。在基因治疗中,靶向性差的载体介导的外源目的基因表达会造成全身广泛的副损伤。只有单纯疱疹病毒载体靶向性较强,此类病毒通常感染神经末梢并表现为潜伏感染。这一显著的嗜神经特性已被用来进行脑部肿瘤的基因治疗。

 

2.6外源基因导入率低

病毒性载体因其来源于病毒,具有病毒本身的感染性,故其转染率较高。但是,要提高病毒滴度也非易事。非病毒性载体的转染率则难以提高,而转染率低则外源基因导入率则会更低,势必影响治疗效果。

 

2.7 随机插入突变

外源目的基因导入宿主细胞后,会整合至细胞基因组中,整合位点对于其引起的结果起决定性作用。但是大部分载体的插入位点都是随机的,只有腺病毒相关病毒总是在19号染色体

的特异位点上定点整合。1999年在法国实施的X染色体相关联的重症联合免疫缺陷病(SCID-X1)基因治疗临床试验中,10个受试婴儿中有9名免疫力得到恢复,而1例发生了严重的毒副作用。另有2名婴儿分别在接受基因治疗30个月和34个月时相继表现出T细胞白血病的症状。研究者们认为,反转录病毒是将其基因组DNA随机整合到宿主染色体上,这样就有可能插入到某个癌基因附近引发肿瘤。

 

2.8产生具有复制能力的野生型重组病毒

病毒性载体通常是将其基因组中的一部分基因置换为外源目的基因,转染宿主细胞。反转录病毒还需要包装细胞的辅助作用。病毒之间的遗传物质会发生基因重组或重配,而产生具有复制能力的野生型重组病毒,使机体感染或出现细胞毒性。

 

2.9可调控性差

基因的治疗效果取决于外源目的基因在体内的表达情况。但是,载体将外源目的基因导入宿主细胞后,目的基因并不一定完全按照需要适时、适量和适度地进行表达。目前,载体的调控能力较差,也是影响基因治疗效果的一个重要因素。

 

2.10免疫原性问题

无论是病毒性载体,还是非病毒性载体,对于机体来说都是异物,都会引起免疫反应。尤其是腺病毒载体,可引起强烈的免疫反应,而使基因治疗用的重组病毒自身遭到人体的清除,因而导入的外源基因就不能在体内长期表达,其结果不仅影响基因治疗的效果,而且对病毒的免疫应答也会对机体造成一定的损伤。

 

3 肿瘤基因治疗载体未来的研究趋势

 

基因治疗载体的基本要求是安全、有效。理想的要求还要加上靶向性好、可调控、长期稳定、容量大、易选择、易转移、穿透性能好、适度表达和制备方便等标准。现实应用的载体均不能达到理想标准。尽管构建基因治疗载体的难度很大,现存的问题也很难解决,但是各国学者仍在努力利用各种先进的技术和方法来研发符合临床治疗需要的新型载体。从最近的研究动态来看,肿瘤基因治疗的载体研究趋势主要集中在以下几个方面。

 

3.1安全性研究

基因治疗开始于1990年,美国的Rosenberg研究小组的第一例基因治疗晚期黑色素瘤患者获得成功,至今已有10余年。肿瘤基因治疗手段日益增多,为很多患者挽救了生命,但是安全性问题也一再警告人类,基因治疗不能盲目乐观,需要冷静思考,要面对和解决安全性这个首要问题。1999年至今,全世界的基因治疗临床试验逐年减少。这主要是因为临床试验的条件更加严格,其根本目的是为了保证受试者的生命安全。

病毒性载体可整合于细胞基因组中。这一方面能够使目的基因长期、稳定表达,另一方面也可能造成插入突变而引起新的肿瘤,位点特异性整合技术可使这一难题得到解决。还可通过在载体中连接染色体绝缘子基因使目的基因整合于染色体后不会引起相邻基因的活化。基因治疗载体可能对机体产生细胞毒作用,并会引起机体的免疫反应,这些都可能造成机体的损伤。目前,已有多种方法来减低这些毒性。如单纯疱疹病毒的细胞毒作用,通过去除其病毒感染早期所产生的蛋白基因如ICP0,ICP4ICP27ICP22而减低该毒性。

 

3.2 高效性研究

高效性包括转染高效和表达高效两个方面。病毒性载体因其来源于病毒而转染效率较高。但是,近年来随着用病毒性载体进行临床试验的一系列不安全问题的出现,促使人们致力于研发大量非病毒性载体。而这类载体虽然具有制备简单、可插入外源基因片段的大小不受限制、安全性好等突出的优点,但他们与传统的病毒性载体相比,最明显的劣势即是其转染低效性。纳米医学技术的产生和发展为提高非病毒性载体的转染率带来了新的曙光。

在肿瘤的基因治疗中,虽然外源基因在体内得以表达,但表达量较低也达不到治疗作用。所以,提高外源目的基因的表达效率也是肿瘤基因治疗中非常重要的环节。可通过将外源基因置于增强子调控之下,来协同目的基因的表达。Aldo等利用人甲胎蛋白(dfetoproteinAFP)启动子序列在人、大鼠细胞中启动目的基因的表达,并应用含这种启动子的反转录病毒载体在AFP阳性的肝癌细胞株中取得了高效特异表达自杀基因的效果。

 

3.3靶向特异性研究

目前肿瘤基因治疗载体缺乏选择性,对于正常组织和肿瘤组织亲嗜性无明显差异,使载体进入体内后无法特异性地集中于肿瘤组织,而其所携带的目的基因往往会对正常组织产生毒副作用,造成机体损伤。所以,提高载体的靶向性是肿瘤基因治疗的研究热点。从基因治疗的原理考虑,提高载体靶向性的策略可分为两种。

第一种策略是在载体中插入组织特异性标志物的基因,使载体只能识别特异组织细胞表面的受体而与之结合,从而进入特异组织。病毒性载体和非病毒性载体可通过将肿瘤细胞表面受体的配体交联在聚合物上而使之具有对肿瘤细胞的亲嗜性。Chiu等通过将抗体交联在聚乙烯亚胺上提高对肿瘤的靶向性。还可利用生物本身的特性构建靶向性的载体。Condiotti等构建的猫科动物慢病毒载体对肝细胞有特异性,从而为基因治疗代谢性疾病提供了方法。Fox等在体外证明经基因工程改造的拜氏梭菌具有良好的靶向性并能高效表达导入细菌内的外源性自杀基因的产物。反转录病毒载体的靶向性主要由其包膜中的蛋白决定,故可通过改进包装细胞系而增强这类载体的组织细胞特异性。

第二种策略则可以在载体中将目的基因与组织特异的表达调控元件相连,使之只能在特定的组织中才能进行表达,即使进入其他组织,也不会表达,因而避免了副损伤。这一类方法主要是根据肿瘤细胞内的代谢特点如厌氧、端粒酶活性较高等,可将低氧启动子、端粒酶启动子连在目的基因前,使之只在肿瘤组织中特定的条件下进行表达。

 

3.4 多功能基因的联合研究

肿瘤的发生机制复杂,有很多因素如癌基因、抑癌基因、免疫等均对其发病有一定影响。所以,在肿瘤的治疗中,可联合使用多个外源目的基因,使之发挥各自的作用,以达到协同治疗的目的,比采用单一基因进行治疗效果更加显著。如Barzon等将白细胞介素一2基因和单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因同时插入反转录病毒载体治疗甲状腺癌。前者具有激活机体的抗肿瘤免疫功能,后者为自杀基因,可使瘤体比单独利用白细胞介素一2基因进行治疗时缩小34倍。

基因治疗为肿瘤的治疗带来了一场革命,而且经过10余年的临床研究,已经取得了长足的进步。获得我国国家批准的第一个基因治疗药物重组人p53腺病毒注射液已于2004年正式上市。虽然目前肿瘤基因治疗载体还存在一些问题,相信在全世界学者的努力下,基因治疗将会挽救更多的肿瘤患者。

 

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