亚甲蓝灭活病毒的机理
亚甲蓝(MB,又称作美兰)是一种光敏染料,属酚噻嗪衍生物,其对病毒的毒性作用早在1933年就被人们描述过。亚甲蓝与核酸的G-C碱基对具有较大的亲和性,在有光照的条件下,亚甲蓝分子吸收光能后可激发产生单态分子氧(1O2),这种单态分子氧通过修饰鸟嘌呤碱基而影响核酸,使其产生缺口,引起核酸链的断裂或导致碱基位点丢失,从而阻止其复制。尤其是8-OXO-7,8-二羟鸟嘌呤在DNA和RNA链中形成。
因此,病毒核酸是亚甲蓝光灭活处理的最主要的靶结构。亚甲蓝光敏染料穿透病毒外壳并与病毒核酸相结合,这就解释了为什么脂包膜病毒容易被灭活,而大多数非脂包膜病毒不被灭活或不受影响的原因,究其原因可能在于非脂包膜病毒对光灭活具有抗性,推测非脂包膜病毒的核酸被更紧密地包裹起来,或者被其蛋白外壳保护起来,以防光敏化合物穿入病毒的核,这也是脂包膜优先被光敏染料结合的证据。
有相关学者观察到亚甲蓝光灭活处理的单纯疱疹病毒的外壳蛋白发生改变,实验证明,亚甲蓝/光照产生的许多反应物质,包括单态分子氧、氧自由基均与病毒灭活有关。亚甲蓝分子在水溶液中带有阳性电荷,这可能是亚甲蓝具有高度的亲和带有阴性电荷的脂包膜病毒的能力的原因。而脂包膜病毒具有阴性电荷的原因可能是宿主细胞外膜上的磷脂所形成的。在亚甲蓝分子与脂包膜亲和之后,进而对脂包膜病毒的膜蛋白和核酸链产生破坏作用。
亦有研究表明,仅仅在HIV-1的逆转录酶(RT)分子与其他蛋白进行交联的情况下才可能解释RT活性下降或丢失的现象。说明,亚甲蓝/光照处理导致病毒灭活是光敏染料和光二者共同作用的结果。
亚甲蓝/光照处理用于血浆的病毒灭活
早在20世纪30年代,Clifton和Perdrau等就发现亚甲蓝/可见光处理可以灭活病毒,从此之后用亚甲蓝灭活各种动植物病毒的应用性研究引起人们广泛的关注。人们发现这种方法可以灭活大多数具脂包膜的DNA和RNA病毒。
人们利用亚甲蓝分子所具有的阳性电荷使其能与带阴性电荷的脂包膜病毒的脂包膜相亲和,进而通过可见光照射,被亚甲蓝分子包被的病毒在自由基的作用下发生光氧化以致使核酸断裂进而不能复制的原理,开发了一种适用的方法,这种工艺流程的主要步骤是:将新采集的血浆置低温(-30℃)下速冻并解冻,以便破坏细胞并释放细胞内病毒※合并1 000人份,6小时内采集的新鲜血浆※用1μm的微孔滤膜过滤※按终浓度为1μmol/L加入亚甲蓝※在4～10℃环境中,以光强度为36 000～38 000Lux荧光照射60分钟(因试验而异,亦可用其他可见光强度为60 000 Lux下照射)※用吸附剂吸附亚甲蓝※过滤去除吸附剂※分装至冻干瓶※旋冻※冻干。
实验结果表明,病毒灭活的效力取决于光强度、照射时间及亚甲蓝浓度。如在血浆中加入滴度大于6log TCID50的Sindbis病毒(HCV的模型病毒)、鸭乙肝病毒、VSV及HSV等脂包膜病毒后用亚甲蓝/光照处理可彻底灭活上述模型病毒,对许多非脂包膜病毒如SV40、腺病毒以及HEV的模拟病毒Calici病毒也能有效地灭活。
亚甲蓝的安全性
近年来,由于加强了献血员的筛选以及有效的实验室检测,使感染性相关输血的危险性不断降低,这就要求人们考虑所用的杀病毒制剂必须是毒性非常低的物质。亚甲蓝作为一种杀病毒制剂,它的一个主要优点就是它是一种使用比较广泛的治疗性药物。
亚甲蓝的临床用于血浆病毒灭活的亚甲蓝使用剂量是极其微量的。资料表明,对于光灭活使用的1μmol/L的必要剂量,即300μg/L而言,在这一浓度作用下,如果在处理后不去除染料的话,对受体而言也是不会有毒性问题的,这一剂量只相当于高铁血红蛋白血症临床治疗剂量的几百分之一。更何况在亚甲蓝/光照处理工艺流程中还加有一道用吸附剂去除亚甲蓝的工序,即通过此道工序处理可将血浆中加入的亚甲蓝含量去除85%以上。
倘若去除前亚甲蓝在血中的含量为0.038 mg/100 mL,则在吸附去除后,其含量仅为0.0057mg/100ml,如一人一次输注0.034 2 mg的亚甲蓝,为临床最小剂量的1/1 460;倘若一人一次输注2 000 mL血浆,则输入亚甲蓝的量仅为0.114mg,为临床最小剂量的1/440,可想而知,在此剂量之下应无化学毒性之虑。
虽然杀病毒所用剂量和临床用量相差甚远,但是仍需考虑亚甲蓝的这种病毒灭活剂量的毒性作用,例如在人血浆光灭活处理过程中所用的浓度在有光照情况下可以引起DNA损伤等。
国外对亚甲蓝的安全性作了大量研究,动物体内的急性毒性试验结果表明,亚甲蓝的小鼠半数致死量为40～125mg/kg体重。细菌试验表明,光照处理血浆中的亚甲蓝不具有致畸性。在体内试验中亦未见到致畸现象。
在亚甲蓝浓度高达62 mg/kg(相当于167mmol/L·kg-1的情况下,通过小鼠微核测定所获得的体内结果亦呈阴性,接受静脉注射亚甲蓝的动物的多色红细胞中的微核频率的增加同载体对照相比没有明显的差异,但在体外试验中,亚甲蓝却可显著增加小鼠淋巴细胞中胸苷激酶突变频率。
由此可见,亚甲蓝对培养细胞可致突变,但在体内试验中却未发现遗传毒性。另外,据知,亚甲蓝在体内能够变成亮亚甲蓝,亮亚甲蓝似乎不具有平面结构,比母体更具疏水性,不吸收可见光,故不参与光诱导性突变,因此,可使亚甲蓝的遗传毒性降得更低。
另外,人们从亚甲蓝/光照处理血浆蛋白后,有可能使血浆蛋白发生结构上的变化,从而形成新抗原的角度出发,对亚甲蓝/光灭活处理血浆是否存在新抗原的问题进行了研究,人们发现通过DEAE Si500柱离子交换层析后的未处理及处理血浆的洗脱图谱所呈现的峰形没有任何区别。
在动物试验中,小鼠抗血清也未测出lgE抗体。说明经亚甲蓝/光灭活处理的血浆没有产生新的抗原结构。总而言之,人们普遍认为这种方法是安全的,亚甲蓝/光照处理法用于血浆中病毒的灭活是—可选择的切实可行的方法。
亚甲蓝/光照处理的病毒灭活血浆的临床应用
亚甲蓝/光照处理血浆已在欧洲临床应用多年。早在20世纪80年代初期,德国红十字会就将亚甲蓝/光照处理法用于血浆的病毒灭活,1992年德国红十字会正式生产这项产品。1992～1997年德国和瑞士已有80万单位的亚甲蓝/光灭活处理的新鲜冰冻血浆(简称MB-FFP)应用于临床。通过数年的观察,临床使用结果证实,未见MB-FFP传播脂包膜病毒感染以及发生未料到的副反应的报告,由此可见亚甲蓝/光照处理法能彻底灭活血浆中的脂包膜病毒,临床应用是安全的。
正是亚甲蓝/光照处理法能彻底灭活血浆中的脂包膜病毒，亦同样能应用于HIV病毒，铂鑫生物根据其原理，研制出国内首创艾滋病治疗仪。2003年，铂鑫生物的艾滋病治疗仪开始立项，公司先后承接国家“863”计划(研究专项“血浆病毒灭活装置的研究”课题)及全军“十五”指令性课题(研究专项“血液快速检验和病毒灭活方法与装备研究”课题)，最终成功研制出了第一代血浆病毒灭活仪，为其艾滋病治疗仪的成功研发奠定了理论与技术基础。
治疗仪临床试验取得重大进展之后，铂鑫生物在2018年4月成功申报了其血浆病毒灭活仪的发明专利(专利号：201810368896.7)，同时亦取得其“用于治疗艾滋病的自体血浆灭活疫苗的光化学制备方法”的发明专利(专利号：201810368096.5)。同年5月，铂鑫生物“非药物融合阻断疗法治疗HIV/AIDS有效性和安全性研究”课题通过国家著名艾滋病防控专家组的验收。
2019年7月至9月，铂鑫生物分别与重庆市公共卫生医疗救治中心、首都医科大学附属北京佑安医院、天津市第二人民医院签订了临床试验合同，2020年4月又加入河南第六医院作为第四个中心，同时展开艾滋病治疗仪的三期正式临床试验，试验共入组150位患者。
据悉铂鑫生物的艾滋病治疗仪预计将于2021年Q2申报上市申请，并于2021年Q4取得三类医疗器械设备许可。随着其三期临床试验的展开，及艾滋病治疗仪上市申请程序的启动，全球艾滋病患者有望尽早在市场上看到这个新型的艾滋病治疗仪，并亲身体验铂鑫生物的艾滋病自体免疫疗法，看是否能因此受益。
近期市场亦传闻铂鑫生物将启动赴港IPO，这几年港股IPO赛道持续火热，尤其是2018年香港上市新规施行后，未盈利生物科技公司扎堆涌向港股，铂鑫生物此行也算赶上热潮，且看其进军香港资本市场的道路会否顺利吧。