外界刺激，尤其是力、电等物理刺激对活体细胞的增殖、分化、迁移甚至是病变等行为具有显著影响，因此细胞响应机制问题吸引了广泛的关注和研究。 目前常见的细胞力学应激特性研究方法主要为化学方法和物理方法。 化学方法是利用化学药物破坏细胞结构，例如细胞松弛素破坏肌动蛋白微丝，秋水仙素或诺考达唑破坏微管等，通过细胞功能变化验证被破坏部分的力学生理作用。 这种方法可能对细胞造成一定的副作用，难以准确定量地研究细胞应激特性变化。 物理方法是指对细胞直接施加作用力的方法，例如光镊操控、流体剪切力法、直接牵拉培养基底等。 然而，这些方法大多是对细胞整体施加力刺激，不仅难以对受刺激细胞进行准确的受力分析和定量研究，也不利于研究细胞的应激机制以及传导机制。
电学刺激对细胞行为同样具有显著影响。 前人的研究表明，外界电场的施加会明显改变细胞的形状和迁移方向与传统力学刺激方法一样，细胞整体处于电场中也不利于电应激传导机制的研究。 膜片钳是目前最有效的细胞电学特性测试仪器之一，可以对细胞膜电位、单离子通道特性等细胞局域电学特性进行精确测量。然而膜片钳仪器操作困难，破膜操作时容易导致细胞的死亡，降低了实验的成功率。 因此，开发一种可以对细胞施加定量局域作用的、非侵入的、并且易于操作的生物探针对细胞力学、电学响应特性进行研究是必要的。
本研究利用碳纳米线圈作为柔性生物探针，对骨肉瘤细胞施加了局域的力和电刺激，并基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energytransfer, FRET)技术观察了细胞的受激反应。 研究结果表明，碳纳米线圈探针可以对细胞施加有效刺激并使细胞产生空间极性响应，并观察到了细胞局域响应的扩散与传导现象，为进一步研究细胞应激传导机制提供了一种有效的研究手段。
1 实验
1.1 合成碳纳米线圈
本研究中所使用的碳纳米线圈是用铁−锡−氧催化剂通过热化学气相沉积法制备的。 用浓度为0.2 mol/L的Fe2(SO4)3·9H2O和SnCl2·5H2O的溶液作为催化剂前驱体，通过滴涂法将前驱体溶液担载到石英基板上并在空气中干燥45 min。 之后将基板放置在化学气相反应炉中，在710 ℃下的氩气保护环境中煅烧30 min，氩气流量为6.1 mL/s。 煅烧完成后，向反应炉中通入乙炔和氩气，流量分别为0.25 mL/s和5.4 mL/s，在710 ℃下沉积生长2 h，最终得到所需的碳纳米线圈样品。 用钨丝针尖从制备的团簇样品中抽取出单根碳纳米线圈，无需二次处理即可直接作为生物柔性探针。碳纳米线圈的扫描电子显微镜图片。 可以看到碳纳米线圈整体呈准一维状，同时具有独特的亚微米尺度螺旋结构。
1.2 培养骨肉瘤细胞
本实验中选用人骨肉瘤细胞(osteosarcoma cell, U−20S)。 该细胞来源广泛，易培养而不易死亡;细胞尺寸适宜，便于观察和开展实验。骨肉瘤细胞株由中科院上海细胞库购得。 使用89%RPMI 1640缓冲液(HyClone, 美国)，10%胎牛血清(Sigma−Aldrich, 美国)和1%的青霉素/链霉素溶液(Gibco, 美国)配制细胞培养基。 在此培养基中接种细胞，放入温度为37 ℃，二氧化碳体积分数为5%的培养箱中。骨肉瘤细胞的光学照片，多数细胞呈不规则形状，处于贴壁状态，显示细胞活性良好。
1.3 设计和转染荧光探针
利用FRET技术表征骨肉瘤细胞的受激响应特性。 通过基因工程技术将含有一个荧光供体基团和一个荧光受体基团的荧光探针植入到细胞当中，当细胞受到外界刺激做出响应时，供体与受体之间的距离会相应改变，二者的荧光发光强度将迅速发生变化，从而实现细胞反应的可视化显示。 本实验用青色荧光增强蛋白(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP)作为荧光供体基团，其发射波长峰值为480 nm;用黄色荧光蛋白(yellow protein for energy transfer, YPet)作为荧光受体基团，其发射波长峰值为535 nm;激发光波长为440 nm。
1.4 细胞荧光特性表征
通过荧光显微镜(Olympus IX73, 日本)观测细胞荧光变化情况。同一视野中骨肉瘤细胞的明场照片，及其供体和受体基团的荧光照片。 由于细胞受到外界刺激前后荧光探针的供体基团和受体基团的发光强度会产生变化，因此可以采用荧光比(即供体与受体的发光强度比，I供/I受，FRET ratio)作为细胞应激特性的指标。 通过连续拍摄细胞的荧光照片，并使用Matlab软件(MathWorks, 美国)对拍摄得到的荧光图片进行处理，即可算得荧光比变化趋势，进一步细胞的受激响应行为变化。
2 结果与讨论
2.1 细胞力应激性研究
2.1.1 细胞在局域横向推力刺激下的响应特性
将单根碳纳米线圈探针固定在三维微操作仪上，可以对碳纳米线圈的位置实现微米级的精确调控，从而实现对骨肉瘤细胞定量施加局域作用力。
2.1.2 细胞在局域正压力刺激下的响应特性
为了进一步研究骨肉瘤细胞的力应激特性，对骨肉瘤细胞施加了持续恒定的正压力刺激。 将碳纳米线圈探针正压在骨肉瘤细胞的上表面，对细胞施加法向(垂直于细胞所在平面)正压力。细胞荧光比随时间变化曲线。 可以看到，细胞荧光比仍然随时间逐渐增长，但变化量相对较小(～10%)，且没有观察到细胞荧光比的极性分布现象。 这可能是由于骨肉瘤细胞处于贴壁状态，其内部骨架构成的力传导通道平行于培养基板排列，而碳纳米线圈施加的作用力位于细胞中央区域，且没有横向分量，不能引起细胞膜的显著横向流动和力刺激向其它区域的传导，因此不能观察到细胞的极性响应。 这一结果侧面验证了前面横向推力刺激实验的结果和分析。 由以上研究结果可以看到，利用碳纳米线圈柔性生物探针可以对单活体细胞施加不同形式和大小的作用力，有助于全面研究细胞力学应激特性。
2.2 细胞电应激性研究
由于碳纳米线圈具有优异的电学特性，可以将其作为柔性生物电极对细胞施加局域电刺激。 当碳纳米线圈与细胞接触时，其电位可以引起接触点附近引起细胞膜电位发生反转，从而对细胞产生局域电学刺激，在细胞中植入钙离子荧光探针可以显示细胞受到电刺激后的响应情况。 用信号发生器施加电刺激信号，碳纳米线圈被固定在三维微操作仪上并引出电极接在信号发生器的负极。 由于细胞离子通道的激活时间一般在百毫秒量级，之后就会自动处于失活状态，经过一段时间才会逐渐恢复到静息状态，因此施加持续稳定的电信号并不能使离子通道处于常开状态。 基于以上认识，采用了周期性脉冲电刺激的方式，电学参数为周期7 s、脉冲宽度100 ms、幅度−100 mV。 铂电极作为对电极置于细胞溶液中，将细胞溶液的电位钳制为0 V。
3 结论
本研究探索了碳纳米线圈作为柔性生物探针在细胞力学、电学应激性研究方面的应用。 笔者首次利用碳纳米线圈探针对骨肉瘤细胞施加定量局域作用力，发现细胞的受激响应与力刺激的形式和大小有关，在局域侧推力的作用下显示出极性响应。 另外，用碳纳米线圈作为电极对细胞施加了局域电刺激，发现细胞表现出了明显的极性响应以及响应传导行为，细胞荧光比变化可达40%。 并且当电刺激撤销后，受激细胞可恢复初始状态，证明碳纳米线圈具有安全可控性。 天然的生物兼容性、优异的力学性能和微小尺寸使得碳纳米线圈可以作为非侵入柔性生物探针对细胞施加局域刺激，是活体细胞的力、电刺激响应和传导机制研究、细胞动力学行为调控等领域的一种新型有效手段。
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