乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，发病率占女性恶性肿瘤首位，约为30%，死亡率居第二位，占女性所有恶性肿瘤死亡率的14%。
预计到2030年，全球乳腺癌的发病人数和死亡人数将分别达到264万和170万。近年来在乳腺癌早期筛查、诊断及综合治疗等方面都取得了较大进步，但乳腺癌伴转移患者的5年生存率仍处于低水平，国内外学者一致认为转移是乳腺癌患者死亡的主要原因之一，然而至今乳腺癌转移的机理仍未完全阐明。
因此进一步探究乳腺癌转移的发病机制以确定有用的生物标志物并探索新的治疗方法成为一项重要的任务。近年，基于肿瘤免疫逃逸理论，针对免疫检查点的肿瘤免疫疗法开始兴起并被认为有望解决这一难题。
值得关注的是，B7超家族分子中PD-1/PD-L1作为近几年最热门的肿瘤免疫治疗靶点，其单抗治疗在临床上已取得显著疗效，然而B7家族其他分子在肿瘤免疫逃逸中如何发挥作用仍需进一步深入研究。
B7-H3作为B7超家族成员，是CHAPOVAL AI等2001年从人树突状细胞(dendritic cell，DC)的cDNA库中克隆得到的，属免疫球蛋白超家族成员。B7-H3基因包含7个外显子和6个内含子，蛋白大小为316个氨基酸。
B7-H3蛋白属于I型跨膜蛋白，包含一个信号肽(28aa)，一个细胞外的免疫球蛋白恒定(IgC)和可变区(IgV)、一个跨膜区和一个含有45个氨基酸的胞内区E。研究发现B7-H3在绝大多数恶性肿瘤细胞中高表达，其表达与患者临床病理特征、转移、侵袭及不良预后密切相关E，学界开始将目光瞄准B7-H3分子，有望成为下一个免疫治疗的热点。
上皮间质转化(EMT)是肿瘤恶性表型转化的启动过程，是乳腺癌细胞突破基底膜发生侵袭-转移级联反应的第一步;是乳腺癌细胞获得转移的重要机制，可促进恶性肿瘤的侵袭、转移，在肿瘤的研究中受到越来越多的关注。
EMT过程中，细胞由多角形上皮细胞形态转变成纺缍形的间质细胞形态，失去细胞极性，迁移和侵袭能力大大增加。其主要分子特征如E-cadherin、ZO-1等上皮标记物表达下调和vimentin、aSMA等间质标记物表达上调赋。
本课题拟利用siRNA沉默人乳腺癌MDA-MB-231细胞中B7-H3表达，探究B7-H3对MDA-MB-231细胞EMT、迁移及增殖的影响，明确B7-H3与肿瘤恶性表型的关系，为进一步研究其具体分子机制奠定实验基础。
材料与方法
1.1 主要材料与试剂
人乳腺癌细胞系MDA-MB-231为本实验室冻存，复苏使用。DMEM高糖培养基，G418均购自美国Gibco公司;小牛血清购自浙江天杭四季青公司;B7-H3干涉载体pSi-lencer4.1-CMV neo/B7-H3及无关干涉载体pSilencer4.1-CMV neo/NC为本实验室前期构建并存留;脂质体Lipo-fectamine1M2000试剂盒购自Invitrogen公司;
RNA提取试剂盒、反转录试剂盒及各种酶等均购自TaKaRa公司;鼠抗人B7-H3单克隆抗体购自Abcam公司;鼠抗人GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG均购自中杉金桥公司;实验所用PCR引物均由北京奥科生物技术有限公司合成。Transwell小室购自美国康宁公司。
1.2 实验方法
1.2.1细胞株培养
人乳腺癌细胞系MDA-MB-231培养于含10%小牛血清的DMEM高糖培养基，置于5%CO2，37龙饱和湿度培养箱传代培养，实验所有细胞均取自对数生长期细胞。
1.2.2 B7-H3沉默细胞株的建立
常规胰酶消化处于对数生长期MDA-MB-231细胞，制备5 x 105/mL细胞悬液，按2 mL/孔接种于6孔板。24小时后，待细胞密度达到70%~80%，利用脂质体Lipofectamine，™2000试剂盒转染B7-H3干涉载体pSilencer4.1-CMV neo/B7-H3和无关干涉载体pSilencer4.1-CMV neo/NC'1’，具体操作步骤参考Invitrogen公司说明书，转染5小时后更换为完全培养基，24小时后加入G418(800 Mg/mL)进行筛选，至空白对照孔全部死亡后，收集混合细胞株，命名为MDA-MB-231-ShB7-H3组及MDA-MB-231-ShNC组，后续实验加入未转染对数生长期MDA-MB-231细胞作为空白对照(MDA-MB-231-WT组)。
1.2.3 qRT-PCR检测B7-H3沉默及EMT标志分子表达情况
分别收集对数生长期WT组、ShNC组和ShB7-H3组细胞1 x 106个，利用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，再反转录为cDNA，以后者为模板进行qRT-PCR检测B7-H3在mRNA水平表达情况，以及EMT标志分子E-cadherin、ZO-1、vimentin和aSMA的表达情况，以GAPDH作为内参(qRT-PCR引物见表1)。
1.2.4 Western blot检测B7-H3沉默及EMT标志分子表达情况
分别收集对数生长期WT组、ShNC组和ShB7-H3组细胞5 x 106个，每组细胞加入200μl RIPA细胞裂解液(含1%PMSF)，冰浴摇床裂解45分钟，12 000 r/min，4℃离心20分钟，取上清。BCA法蛋白定量，各取40μg蛋白样品上样，进行12%分离胶的SDS-PAGE电泳，电泳结束后半干法转至NC膜，5%脱脂牛奶室温摇床封闭2小时，一抗4℃摇床过夜孵育(B7-H3单克隆抗体，1：150稀释;E-cadher-in单克隆抗体，1：2000稀释;Z0-1单克隆抗体，1：1 000稀释;vimentin单克隆抗体，1：1 000稀释;aSMA单克隆抗体，1：1 000稀释;GAPDH单克隆抗体，1：2 000稀释)，次日TBST洗涤NC膜，二抗4龙摇床孵育4~5小时(辣根过氧化物酶标记二抗，1：4 000稀释)TBST漂洗后，与ECL发光试齐反应，暗室中进行X光胶片曝光、显影和定影。
1.2.5 Transwell细胞迁移和侵袭实验
将Transwell小室放入24孔板中，上室中分别加入100以WT组、ShNC组和ShB7-H3组细胞悬液(2 x 105 cells/mL无血清培养基)，下室中加入600^L含10%小牛血清的DMEM完全培养基;细胞常规培养48小时后，分别取岀小室，弃去孔中培养液，D-Hanks淋洗小室，用棉签轻轻擦去小室上层未迁移细胞;用95%乙醇室温固定细胞5分钟，D-Hank's洗涤细胞3次;1%结晶紫室温染色10分钟，D-Hanks洗涤3次;倒置光学显微镜下(放大倍数为400倍，随机计数10个视野)观察和计数迁移到下室的细胞数，以此表示细胞的迁移能力。
细胞侵袭实验与细胞迁移实验检测方法相似，实验前预先在Transwell小室的上室中加入100 pX Matrigel胶(0.2 mVmL)，待其凝固后进行细胞侵袭实验。
1.2.6 MTT细胞增殖实验
分别取对数生长期WT组、ShNC组和ShB7-H3组细胞悬液各100 pL(6 x 104 cells/mL)，接种至5块96孔板，每组3个复孔。细胞常规培养，待贴壁后，随机取岀一个96孔板，每孔换液为含有5%MTT的完全培养基100 pL，37龙孵育4小时。
弃去培养基，每孔加入100 pL DMSO，应用全自动酶标仪570 nm波长处检测每孔吸光度(A值)，以此作为0小时，此后分别于12小时、24小时、48小时、72小时各取岀一个96孔板，检测步骤如上。以细胞培养时间作为横坐标，以A值作为纵坐标，绘制细胞增殖曲线商。
1.3 统计学方法
本实验所有数据均用SPSS 16.0软件进行统计学分析，以，检验进行两独立样本间的比较，以单因素方差分析(ANOVA)进行多组间均数比较，数据以(光±s)表示。设定P<0.05具有统计学差异，所有实验均重复三次。
结果
2.1 MDA-MB-231-ShB7-H3细胞株的鉴定
通过脂质体LipofectamineTM2000转染干涉表达载体，我们成功构建了B7-H3沉默表达的乳腺癌细胞株MDA-MB-231-ShB7-H3及无关干涉对照组细胞株MDA-MB-231-ShNC，利用qRT-PCR(图1)和Western blot(图2)分别从mRNA和蛋白水平检测了B7-H3的表达水平。结果显示，与对照组相比，在MDA-MB-231-ShB7-H3细胞组中B7-H3的表达水平显著下调，从mRNA和蛋白水平分别证明了B7-H3沉默表达细胞株构建成功。
2.2 B7-H3沉默抑制MDA-MB-231细胞EMT进程
分别利用qRT-PCR及Western blot检测ShB7-H3组细胞EMT标志分子在mRNA和蛋白水平表达情况。与空白对照组(WT)及无关干涉(ShNC)组相比，B7-H3沉默组(ShB7-H3)上皮细胞标志分子E-cadherin和ZO-1在mRNA和蛋白水平表达均显著上调，而间质细胞标志分子vi-mentin和aSMA在mRNA和蛋白水平表达均下调，提示B7-H3沉默抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞EMT进程(图3和图4)。
2.3 B7-H3沉默抑制MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力
通过Transwell实验分别检测各组细胞的迁移能力和侵袭能力，48小时后计数分别穿过无基质胶和基质胶包被的小室基底膜的细胞数：在迁移实验中，与WT组和ShNC组相比，ShB7-H3组细胞穿过基底膜细胞数分别下降了46.4%和45.9%。在侵袭实验中，与WT组和ShNC组相比，ShB7-H3组细胞穿过基底膜细胞数分别下降了51.8%和52.8%(图5)。经统计学分析，差异均具有显著统计学意义(P<0.01)。该结果提示B7-H3沉默可抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力。
2.4B7-H3沉默抑制MDA-MB-231细胞增殖
将WT组、ShNC组和ShB7-H3组细胞分别进行MTT细胞增殖实验，以细胞培养时间作为横坐标，以A值作为纵坐标，绘制细胞增殖曲线。结果显示与WT组和ShNC组相比，ShB7-H3组细胞增殖速度明显下调。与WT组相比，ShB7-H3组细胞增殖速度在48和72小时分别下调18.3%和30.0%。与ShNC组相比，ShB7-H3组细胞增殖速度在48和72小时分别下调16.3%和29.9%(图6)。经统计学分析，差异均具有显著统计学意义(P<0.01)。
讨论
肿瘤恶性转移是导致肿瘤低治愈率、高致死率的直接原因。免疫逃逸在肿瘤转移中发挥了至关重要的作用。B7超家族各种分子[B7-1，B7-2，B7-H1(PD-L1)，B7-H2，B7-H3，B7-H4和B7-H6]表达及功能失衡所致宿主免疫不应答是造成肿瘤免疫逃逸的重要因素之一〔'5-'句。近年来B7超家族在免疫逃逸方面所发挥的作用受到学界空前关注及认可，尤其是PD-1/PD-L1作为近几年最热门的肿瘤免疫治疗靶点，其单抗治疗在临床上已取得显著疗效。
与此同时，大量研究表明B7-H3在绝大多数恶性肿瘤细胞中高表达，其表达与患者临床病理特征、转移、侵袭及不良预后密切相关，学界开始将目光瞄准B7-H3分子，有望成为下一个免疫治疗的热点。
最初研究发现B7-H3发挥免疫激活作用，可以促进CD4，及CD8*T细胞增殖，然而随着不断深入研究，有学者发现B7-H3可通过调控免疫细胞或免疫因子分泌从而抑制肿瘤免疫。近年学者又发现B7-H3不仅在肿瘤免疫方面发挥重要作用，而且在多种肿瘤组织中高表达，其表达与患者临床病理特征、肿瘤转移、侵袭及不良预后密切相关。
尤其是在乳腺癌细胞，KIM JY等发现与正常乳腺组织相比，B7-H3在原发性肿瘤中的表达与肿瘤大小和淋巴管侵袭有显著相关性，在转移性乳腺癌中，组织浸润淋巴结越多，B7-H3的表达量越多。然而对于B7-H3在乳腺癌发生、发展及转移方面的具体机制仍有待进一步研究。
基于以上背景，我们利用siRNA方法沉默乳腺癌MDA-MB-231细胞中B7-H3基因表达，发现B7-H3沉默可抑制细胞EMT进程。高度保守的EMT在原位癌细胞向远端以及其他器官转移的过程中尤其重要。EMT是肿瘤恶性表型转化的启动过程，是乳腺癌细胞突破基底膜发生侵袭-转移级联反应的第一步;是乳腺癌细胞获得转移的重要机制，可促进恶性肿瘤的侵袭、转移及耐药，在肿瘤的研究中受到越来越多的关注。
紧接着我们利用Transwell实验检测发现MDA-MB-231细胞沉默B7-H3表达，下调细胞的迁移和侵袭能力，提示在乳腺癌细胞MDA-MB-231中，B7-H3可能通过调控细胞EMT进程，进一步参与细胞的迁移和侵袭。最后，我们又利用MTT细胞增殖实验，检测发现MDA-MB-231细胞沉默B7-H3表达，下调细胞增殖能力。
本课题为进一步研究B7-H3在乳腺癌发生、发展及转移中的具体作用机制奠定了基础，提供了方向。但本研究仍存在不足之处，首先对于B7-H3调控乳腺癌细胞EMT进程的分子机制，需进一步做深入研究。另外本实验仅停留于细胞水平，后续需补充动物实验，深入探讨B7-H3在乳腺癌发生、发展及转移中的作用。