细菌(特别是致病菌或者条件性致病菌)感染一直是临床治疗各类疾病所面临的一项难题。微小的细菌能通过破损的皮肤、粘膜或者血液入侵机体，当自身免疫功能下降或失衡，就可能造成致病菌群的大量扩增，并诱发机体破损部位或组织器官产生脓肿溃烂、炎症因子风暴和组织坏死，最终导致败血症或致死性脓毒性休克口。
已知在生理条件下，当细菌侵入后，天然免疫细胞如巨噬细胞、嗜中性粒细胞等立即响应，识别并吞噬致病菌后形成吞噬小泡，并协同招募胞内线粒体和NADPH氧化酶向吞噬泡内释放大量的活性氧(ROS),进而实现杀伤和清除细菌的作用。这一功能是通过其活化后发挥的吞噬和杀伤作用来实现的，然而其具体机制一直以来都不甚明了。
在哺乳动物中Hippo信号通路上游关键激酶Mstl和Mst2与果蝇中Hippo激酶属于同源物，该通路在进化过程中十分保守，通过接受上游生长抑制信号从而引起下游信号级联反应元件WW45、Mobl和Lats1/2、NDR1/2发生激酶级联反应，最终将下游效应因子Yap和同源物Taz磷酸化，使其滞留在细胞浆中并被降解，起到抑制Yap/Taz转录共激活的作用，从而发挥着调控组织器官大小和促进细胞增殖或死亡的功能。
近年来的研究工作显示Hippo信号通路在调控肿瘤发生发展、干细胞功能调控和组织再生方面具有十分重要的作用本课题组围绕Hippo信号通路关键激酶Mst1和Mst2在免疫系统中的功能开展了一系列的研究，发现该通路在免疫功能调节中发挥重要作用。我们揭示了Mst1激酶和Rassf家族中Norelb参与了对Naive T细胞增殖和活化的负调控E。Mst1基因缺失会导致初始T细胞减少，活化效应T细胞大量增加，从而造成严重自身免疫性疾病。
近年来关于Hippo信号通路在获得性免疫系统中作用的研究愈发广泛，然而,Hippo信号通路在天然免疫系统中扮演何种角色还知之甚少。
2012年来自德国汉诺威医学院的研究团队发现了一种新的人类原发性免疫缺陷综合症临床表型，即患该病患者出现复发性、易感性细菌或病毒感染、黏膜与皮肤的念珠菌感染，皮肤出现化脓性肉芽或脓肿，并且伴随有淋巴细胞和嗜中性粒细胞减少的症状。
经过后期分析后发现病人体内Mst1基因出现家族性遗传性突变，使得Mst1基因不能表达。这项研究为我们展示出Hippo信号通路上游关键激酶Mst1对于人的免疫系统和宿主抵御感染的过程是不可或缺的，但这项研究仅仅是展现出Mst1在免疫系统防御机制中发挥的部分作用，还远远不能阐明Hippo信号通路Mst1/2激酶在这一过程中到底扮演了何种关键角色。
Mstl和Mst2缺失型小鼠表现出明显的严重病原体感染和自身免疫疾病
本课题组长期从事Hippo通路研究，通过基因敲除、敲入或转基因手段发现Hippo通路在组织稳态维持中起到十分重要的作用。在本项研究工作中，我们发现在小鼠骨髓造血干细胞中敲除Mstl和Mst2会造成严重病原体感染和自身免疫疾病，在此基础上，我们进一步构建了能精确靶向天然免疫细胞如巨噬细胞、嗜中性粒细胞等的Mstl和Mst2敲除小鼠(Mst1/2cDKO)。
通过6—8个月的连续观察，发现其在正常培养条件下并没有表现出很明显的感染和免疫缺陷，于是我们用研究脓毒血症常用的盲肠结扎穿刺(CLP)模型处理野生型或Mstl/2 cDKO小鼠。
结果发现,与野生型小鼠相比，Mstl/2 cDKO小鼠的生存率明显降低。通过对小鼠主要脏器的H&E染色、ELISA检测血清中细胞炎症因子和组织匀浆点板计数发现，Mstl/2 cDKO小鼠表现出对复杂性细菌感染更加敏感、细菌清除能力缺陷等细菌脓毒血症表型。
于是我们用标记的大肠杆菌感染巨噬细胞或嗜中性粒细胞并检测其吞噬和杀伤细菌的功能，结果发现与野生型小鼠相比，Mstl/2 cDKO小鼠巨噬细胞或嗜中性粒细胞在吞噬和杀伤细菌的能力均明显降低。
因为巨噬细胞或嗜中性粒细胞在应答细菌入侵信号时会产生呼吸爆发，释放大量依赖于线粒体和NADPH氧化酶活性的ROS,发挥杀伤和清除功能，所以我们也通过特异性的活性氧探针检测细胞内或线粒体释放的ROS,结果发现与野生型小鼠相比，Mstl/2 cDKO小鼠巨噬细胞或嗜中性粒细胞中线粒体ROS(mtROS)的产生明显减少。
随后我们针对Mstl/2 cDKO小鼠巨噬细胞或嗜中性粒细胞中线粒体功能进行了一系列检测，结果发现与野生型细胞相比并没有很明显的差异。
于是我们将乳胶小球用PBS、LPS或Pam3csk4包被，以Hsp60抗体来标记线粒体，通过免疫荧光染色技术和激光共聚焦显微镜我们观察到与野生型小鼠相比，Mstl/2 cDKO小鼠巨噬细胞或嗜中性粒细胞的线粒体不能够募集到用LPS或Pam3csk4包被的乳胶小球周围，随后通过感染持续表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌实验也同样验证了这一结论。
那么，是否是由于某些调节细胞骨架重构的蛋白有缺陷进而影响线粒体在细胞内的穿梭，导致线粒体向细菌吞噬泡的募集失效呢?随后我们通过细胞骨架染色、GST-PAK pulldown等实验证实小G蛋白Rael在Mstl/2 cDKO小鼠巨噬细胞或嗜中性粒细胞中的活性显著降低。
有文献报道，Racl蛋白在吞噬性细胞应激细菌或病毒的入侵中发挥着关键作用。因此，我们将Mstl/2 cDKO小鼠与在髓系细胞中表达持续激活的Racl(RaclG12V)敲入小鼠杂交，得到Mstl/2 cDKO-RaclG12V小鼠，以验证其是否能够加强Mstl/2 cDKO小鼠对细菌的抵抗能力。
通过免疫荧光染色、细胞骨架染色、GST-PAK pulldown和mtROS探针等一系列实验证实持续激活的Rael确实能够显著恢复Mstl/2 cDKO小鼠巨噬细胞或嗜中性粒细胞的上述免疫缺陷表型。那么，Mst激酶是怎样实现对Rael蛋白的活性的调节呢?
Mstl和Mst2能够通过磷酸化激活PKC介导Rael蛋白的活化，进而促进TRAF6-ECSIT复合体的形成并促进线粒体向细菌吞噬泡的募集
通过蛋白质谱鉴定出PKC家族与Mstl和Mst2存在潜在的相互结合和磷酸化修饰作用，于是我们利用phostag探针鉴定出只有PKCa能够被Mstl和Mst2磷酸化，我们用磷酸化质谱和点突变发现并分析得到了Mstl和Mst2能够同时磷酸化修饰PKCa的第226位丝氨酸和第228位苏氨酸。
有文献报道，激活的PKCa能够磷酸化下游底物LyGDI第3l位苏氨酸介导其与Rael解聚，从而促进了Rael的活化算。同样地，我们通过phostag探针、免疫共沉淀和GST-PAK pulldown也验证了该结论，从而在巨噬细胞内建立了一条Mstl/2-PKCc-LyGDI-Racl级联反应信号通路，这条通路的激活能够导致Rael蛋白的活化。
接下来我们构建了Rael的持续失活突变体质粒(RaclTl7N)和Rael的持续激活突变体质粒(RaclG12V)，通过蛋白质谱鉴定发现,RaclTl7N能够特异性的与TRAF6相互结合并被鉴定出来。TRAF6既是一个E3泛素连接酶，也是TLR信号通路中一个关键的下游接头蛋白口，于是我们想进一步验证TRAF6与Rael之间的关系。
通过免疫共沉淀、构建体内或体外泛素化体系,我们发现Rael上的第l6位赖氨酸可以被TRAF6以泛素第63位赖氨酸依赖的方式进行聚泛素化修饰，后续的实验我们发现，只有能够被活化的Rael才能够被TRAF6泛素化并激活，并保持与TRAF6的低亲和力;而失活的Rael不能够被TRAF6泛素化并激活，并保持与TRAF6的高亲和力。
根据文献报道TRAF6能够与线粒体膜蛋白ECSIT相互作用，介导线粒体向细菌吞噬小泡的募集,于是我们通过免疫荧光染色和免疫共沉淀实验发现Rac1G12V能够加强TRAF6与ECSIT的相互作用，而Rac1T17N能够明显减弱TRAF6与ECSIT复合体的形成。
在Mst1/2 cDKO小鼠巨噬细胞或嗜中性粒细胞中Rael活性明显降低，并且失活的Rac1能够与ECSIT竞争性的结合TRAF6，从而阻断了TRAF6-ECSIT复合体的形成，进而减少了线粒体向细菌吞噬小泡的募集。
有文献报道Rac2的家族遗传突变会导致免疫缺陷，病人嗜中性粒细胞中Rac2的第57位天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N),从而导致粒细胞对细菌的反复感染无法清除，ROS的释放明显降低等症状室。
根据序列比对,Rac2与Rac1蛋白的序列同源性高达80%，于是我们猜想Rac2失活突变导致的这种疾病，是否就是因为上述机制导致的呢?我们通过免疫荧光染色、免疫共沉淀实验、构建腺病毒、GST-PAK pulldown和mtROS探针检测到Rac2D57N突变体确实会阻断TRAF6-ECSIT复合体的形成，从而减少了线粒体向细菌吞噬小泡的募集。
小结与展望
上述研究成果揭示了吞噬性细胞内Hippo信号通路关键激酶Mst1和Mst2通过活化Rae家族蛋白来协同招募胞内线粒体和NADPH氧化酶向吞噬泡内释放大量的活性氧(ROS),进而实现杀伤和清除病原体,在天然免疫和宿主防御中发挥着重要作用。
该研究成果从固有免疫和宿主防御角度解析了人的Mst1基因缺失或Rac2基因突变引发免疫缺陷综合症的致病机理，为研究人类感染性疾病提供了全新视角。由于Mst1缺失与Rac2失活突变引起的人类免疫缺陷综合症表型十分相似，本研究揭示了其内在机制即失活的Rac2可能是通过与TRAF6紧密结合来破坏TRAF6-ECSIT复合体，使得产生的ROS大大减少进而增加了对病原体的易感性。
该成果同时解析了人的Mst1基因缺失或Rac2基因突变引发免疫缺陷综合症的致病机理，为该疾病的治疗提供了可能的细胞和分子生物学依据，同时也为研究人类感染性疾病提供了全新的视角。