肿瘤细胞由原发灶或转移灶脱落进入外周血液成为循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells，CTCs)，这一概念由澳大利亚医生ASHWORTH在1869年首次提出。CTCs存在于血液循环系统中，可通过血液进行微转移，是具有高活力、高转移潜能的肿瘤细胞，与肿瘤的复发、转移密切相关。
近年来，CTCs作为新型生物标志物已成为各类肿瘤研究的热点，在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结直肠癌等肿瘤诊断中得到了较为广泛的应用。目前CTCs在肿瘤的早期诊断、实时个体化用药指导，监测肿瘤复发、阐明肿瘤耐药机制以及改善临床医生对疾病进展和转移的认识方面起着重要作用，近年来，许多学者对CTCs在鼻咽癌的诊断与治疗中的作用开展了大量研究。本文针对CTCs的特性、检测方法、鉴定方法以及其在鼻咽癌中的研究进展做一综述，以提高临床医生对CTCs的认识。
1 CTCs的特性
有研究发现，肿瘤的转移扩散在早期发病时可能就已经出现，而不是之前认为的是肿瘤后期的结果，CTCs可在早期随着血液循环到达并重新定殖于原发病灶或远端器官，保持休眠状态，在特定的条件刺激下释放进入外周血液循环，最终发展成一个明显的复发或转移性病灶。
由于肿瘤细胞的异常增殖和代谢，其基因表达与修饰、蛋白合成与修饰以及某些极性颗粒物质积聚发生异常，导致肿瘤细胞的大小、形态、介电属性和细胞表面的标志蛋白均与正常细胞不同，是分离肿瘤细胞的理论基础。通常，CTCs与正常外周血细胞比较，具有核质比大、体积大(白细胞直径为8~10μm，红细胞为8μm，CTCs为12~25μm)、质量重、密度高等特点。CTCs的细胞表面具有某些特异性的蛋白标志物，是与其他血细胞的区别。上皮细胞黏附分子(epithelialcelladhesionmolecule，EpCAM)是肿瘤细胞特有的标志蛋白，在CTCs中特异性高表达，而在血细胞中不表达。
此外，部分细胞角蛋白(cytokeratins，CKs)，例如：CK6、CK18、CK19，也是其特异性标志物，但是CTCs不表达白细胞的表面标志蛋白CD45。因此，根据以上研究结果将CTCs的免疫组织学概念定义为细胞表面EpCAM(+)/CK(+)/CD45(-)的有核细胞。有研究在健康人体的血液中进行验证，没有发现具有相同免疫组织学特征的非恶性上皮细胞，但在某些良性疾病患者血液中却发现了具有相同免疫特性的细胞，如良性结肠病变、胰腺病变、良性乳腺疾病等，表明有必要对CTCs进行进一步的分子表征分析。
2 CTCs的检测
CTCs的检测主要分为富集以及鉴定两个部分，CTCs的数量在血液中处于极低水平，每106
~107个外周血细胞才可能有1个CTCs，这就要求CTCs检测技术不仅要有较高的灵敏度，以捕获稀少的CTCs，同时也要有较高特异度，以排除外周血中的其余细胞，因此在上亿个外周血细胞中分离富集得到CTCs较为困难，并且这也是CTCs计数及分子特征检测的关键。
2.1 CTCs的富集
根据CTCs的物理学及生物学特性，将CTCs的富集方法分为非特异性富集法及特异性富集法。非特异性富集法是指根据CTCs的密度、大小、表面电荷及可变形等性质对CTCs进行分离富集，其中代表性方法的是膜过滤法和密度梯度离心法。膜过滤法依据CTCs直径普遍大于血细胞直径这一特性，用孔径为8μm大小的滤过膜分离血细胞从而得到CTCs，富集效果较好。
密度梯度离心法根据CTCs与其他外周血细胞密度的差异，通过相应的密度离心递质将CTCs与外周血细胞分离，但这种方法的特异度较低，得到的结果可信度欠佳，在临床上使用较少。特异性富集法指利用特异性抗体与细胞表面抗原进行特异性结合来获取CTCs(阳性分选法)，或者去除血细胞而留下CTCs(阴性分选法)。阳性分选法是通过标记CTCs表面抗原直接捕获CTCs，最常用于阳性分选法的抗原为EpCAM，其是CTCs特有的标志抗原，在CTCs中特异性高表达，而在血细胞中不表达。而阴性分选法则通过CTCs不表达的抗原(如CD45)来去除外周血细胞，以达到富集CTCs的目的。下面将介绍几种具体的CTCs分离富集方法。
2.2 CTCs的鉴定
无论使用哪一种方法对CTCs进行富集，始终不能得到完全纯化的CTCs。因此，必须鉴定所捕获的细胞是否是CTCs。完成这一目标通常的方法是使用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)对所捕获的细胞进行染色，DAPI可与双链DNA结合，证明捕获的细胞具有细胞核，接着再使用不同标记的CKs抗体和白细胞抗原抗体(例如抗CD45抗体)来对这些具有细胞核的细胞进行分析。
富集的CTCs需要进行细胞计数以及分子分型，用于细胞计数的方法主要包括免疫细胞化学技术(如：免疫荧光法及荧光原位杂交法等)和流式细胞术等，用于分子分型的方法主要包括聚合酶链反应(PCR)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术等。也有一些鉴定系统跳过富集步骤，使用简化的方式来识别CTCs，例如：由EPICSciences开发的系统，将血液中的成核组分涂抹到带有可黏附细胞的特殊涂层的载玻片上，随后用DAPI和荧光标记的抗CKs抗体和抗CD45抗体染色载玻片，再用荧光扫描仪扫描，得到反映细胞形态学以及CKs和CD45表达情况的计算机图像。另一种以推定方式鉴定CTCs的方法是通过RT-PCR寻找上皮细胞标志物或相关抗原的转录物。
有研究报道，在乳腺癌患者中，存在着CK-19mRNA阳性的CTCs，因此可认为若使用RT-PCR技术检测到了CK-19的mRNA，则可假设存在CTCs。这种方法灵敏度高，但是这些转录子的存在也不能百分之百代表存在CTCs，需要对细胞进行进一步的表型分析或基因分型，这一方法很难实现。针对这一问题，研究人员发明了新的技术，即theAdnaTest，通过此技术对感兴趣的CTCs基因产物做进一步基因组标志物分析以补充检测的完整性。
3 CTCs在鼻咽癌中的应用
鼻咽癌是一种头颈部恶性肿瘤，是常发于东南亚尤其是华南地区的主要恶性肿瘤之一，其发病与地理分布、环境和遗传因素密切相关，EB病毒(Epstein-barrvirus，EBV)感染、吸烟史、高危饮食习惯等均可能是鼻咽癌的高发因素，但具体病因尚未明确。鼻咽癌是一种放射敏感性肿瘤，其治疗主要以放疗或化疗为主，随着放疗技术的提高，患者的5年生存率也在不断提高，治疗失败的主要原因是原位复发及远处转移，且疾病发展不易监测。但近年来，CTCs的研究为鼻咽癌的诊断、治疗及预后评估提供了新方法。
血浆EBV-DNA定量作为一项无创性检测手段，是鼻咽癌诊治的重要辅助手段，许多研究已将其用于鼻咽癌的诊断、危险分层、监测和预后预测，同时CTCs也逐渐被作为一项有前景的鼻咽癌生物标志物来研究，因此，血浆EBV-DNA与CTCs是否具有协同作用，也成为鼻咽癌CTCs研究的一大热点。
HE等的研究发现CTCs的存在可能与EBV的激活状态有关，CTCs阳性鼻咽癌患者的EB病毒壳抗原相应IgA抗体(EBVVCA-IgA)水平高于CTCs阴性患者，且CTCs计数与EBVVCA-IgA和EBV-DNA载量相关，表明CTCs与鼻咽癌患者EBV活化呈正相关。伍勇等研究也发现在EBV-DNA阴性鼻咽癌患者中，CTCs阳性率为45.5%，而在EBV-DNA阳性患者中，CTCs阳性率为78.9%，表明CTCs和EBV-DNA密切相关，CTCs联合EBV-DNA水平用于鼻咽癌病情的评价。
YOU等在一项纳入270例鼻咽癌患者的研究中发现，CTCs与血浆EBV-DNA水平相比，诊断鼻咽癌远处转移的灵敏度较差，但特异度较好，但两者协同诊断灵敏度及特异度优于单独使用CTCs或EBV-DVA。此外，该研究还发现在基线以及接受一线化疗后这两个时间点，CTCs计数与EBVDNA平相对良好的患者，其无进展生存期和总生存期相对于有不良改变的患者均明显延长，表明CTCs和血浆EBVDNA水平在一线化疗前后和化疗期间均可作为鼻咽癌远处转移患者的重要预后指标。且与影像学检查结合，CTCs和EB-DNA则可以提供更加完善的预后信息。
4 前景与展望
随着CTCs富集与鉴定技术的不断进步，CTCs的临床价值越来越凸显，在鼻咽癌中的研究进展也在不断更新。但是，要将CTCs检测广泛应用于鼻咽癌临床实践中，这条路还任重道远。首先，大量研究中CTCs检测技术的原理和方法不同，且各研究方法缺乏统一的标准，从而导致判断标准及检测结果存在较大差异，缺乏可比性，CTCs检测技术有待进一步规范化和标准化;其次，在鼻咽癌患者中常规进行CTCs检测并不常见，到目前为止发表的研究结果都是在小样本群体进行研究的，CTCs在鼻咽癌中的研究结果缺乏前瞻性多中心大样本研究。不同个体CTCs分子表型存在差异，且同一个体CTCs也具有异质性，也是未来研究的重点、难点。期待在不久的将来CTCs检测可为广大鼻咽癌及各类肿瘤患者带来更大的益处。
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