引言
近年来，纳米技术和纳米生物技术得到蓬勃发展，已成功应用于包括核苷酸、DNA、药物、聚合物和多肽在内的单个分子检测，也已扩展到医疗诊断和DNA测序。本文重点介绍纳米孔检测技术的基本原理、几种应用良好的生物纳米孔、几种应用较广的固态纳米孔，以及该技术在疾病诊断、DNA测序等方面的应用进展。
1 纳米孔单分子分析技术的基本原理
基于纳米孔的单分子分析技术起源于库尔特计数器和离子通道单电流记录技术的发明，其基本原理是：两个电解液室被绝缘膜分隔开，形成顺式和反式隔室，膜上只有一个纳米级的孔连通两腔室。纳米级的孔要么嵌入生物膜中，要么在固态膜中。当向电解液室施加电压时，溶液中的电解质离子通过电泳移动并穿过纳米孔，形成稳态离子电流。
当尺寸略小于孔径的颗粒穿过孔时，流过纳米孔的电流将被阻塞，从而中断电流信号，随后恢复原有信号。将带电生物分子(离子、DNA、RNA、肽、蛋白质、药物、聚合物大分子等)样品添加到一个电解液隔室中会导致生物分子从孔中进入和离开，这会在离子电流信号中产生一系列阻塞电流信号。这些阻塞电流幅度和持续时间传达了样品的许多特性，包括生物分子的大小、浓度和结构。由于纳米孔检测不需要生物分子修饰、标记或表面固定，因此该技术可用于检测各种分子和复合物。另外，还可以定制出不同孔径和表面特性的纳米孔，通过改变施加的电压和溶液条件，用于感测不同类型的生物分子。
2 纳米孔类型
纳米孔可以分为固态和生物两类，两者都有检测纳米级目标分析物的能力，都可用于检测单分子水平的生物分子和化学分子。纳米孔的主要类型及结构与特征。有研究者提出利用生物纳米孔和固态纳米孔的特征来构建混合纳米孔，以进生一物步纳提米高孔检测精度。
2.1生物纳米孔
生物纳米孔也称为跨膜蛋白通道，其优势包括其定义明确且可高度重现的纳米孔尺寸和结构。更重要的是，可以通过现代分子生物学技术轻松地修饰生物纳米孔，例如突变核苷酸序列以改变特定位点的氨基酸残基。2.1.1α⁃溶血素(α⁃hemolysin，α⁃HL)纳米孔α⁃HL纳米孔是第一种也是目前使用最广泛的生物纳米孔，也称为α⁃毒素，是一种由人类病原体金黄色葡萄球菌分泌的外毒素，由293个氨基酸多肽构成，可插入到纯净的双分子层脂膜中形成蘑菇状七聚体，外部尺寸为10nm×10nm，是由一个直径为3.6nm的帽和一个直径为2.6nm的跨膜β⁃桶组成一个232.4kDa的跨膜通道。α⁃HL可以快速将自身插入平面双层中，并在最窄的点形成宽度为1.4nm的纳米通道。α⁃HL通道的内径和单链DNA(ssDNA)分子的大小非常接近(直径为1.3nm)，是检测单个核苷酸的理想器件，使其在分析单分子水平生物分子的相互作用和结构方面有非常广阔的应用前景。此外，α⁃HL纳米孔永久开通不关闭，耐强酸和强碱(pH为2～12)，在高温(接近100℃)、高电压下保持结构、功能稳定。然而，该类型纳米孔亦有不足：有限的孔径(约1.4nm)把其应用范围限制在了ssDNA、RNA或小分子的分析中;而且，其β⁃桶太长，无法直接将单个核苷酸与单个长链DNA分子区分开。
2.1.2MspA纳米孔
耻垢分枝杆菌中的孔蛋白(Mycobacteriumsmegmatispo⁃rinA，MspA)是耻垢分枝杆菌外膜的主要组分，是一种功能强大的纳米孔蛋白，可同时从四个核苷酸读取信息。MspA纳米孔是由八个单体蛋白构成的圆锥状八聚体蛋白孔。孔通道的末端有一个宽约1.2nm、长约0.6nm的短窄的收缩区，与α⁃HL纳米孔相比，该通道相对较小且窄，因此可以提高ssDNA测序的空间分辨率。有研究表明，Ms⁃pA纳米孔可以准确测序phiX174基因组，长度可达4500个碱基。此外，MspA非常耐用，并且在极端的实验条件(pH值0性～14范围内，100℃下保持30min)下可保持通道活。
2.2固态纳米孔
相对于生物纳米孔，固态纳米孔具有许多优势，如化学稳定性、热稳定性和机械稳定性，尺寸可调节和易集成。此外，固态纳米孔可在各种实验条件下正常工作，并且可使用常规半导体工艺批量生产。近年来，固态纳米孔已作为新方法应用于各领域，包括DNA测序、蛋白质检测、分子易位过程和疾病诊断。常见的几种纳米材料有氮化硅(Si3N4)、二氧化硅(SiO2)、氧化铝(Al2O3)、氮化硼(BN)、石墨烯和聚合物膜。固体膜的性质允许其在亚纳米分辨率下生产具有不同形状、尺寸和表面电荷的纳米孔，或者在纳米孔内加入识别元件和附加检测。
2.2.1Si3N4和SiO2纳米孔
Si3N4和SiO2膜由于其低机械应力和高化学稳定性而被广泛用作基底。它们通常是通过在高温(800℃)下进行低压化学气相沉积制成。先用标准的光刻和湿法蚀刻技术在Si侧形成100μm×100μm的窗口，再用聚焦电子束将原子溅射出Si3N4膜，从而在中心钻孔。Si3N4和SiO2基材在高浓度的电解质溶液中也表现出良好的性能，但有研究表明，电解液会随着时间的推移改变Si3N4和SiO2孔的尺寸。
2.2.2Al2O3膜纳米孔
与SiO2和Si3N4薄膜相比，Al2O3薄膜具有较好的电性能、更高的信噪比和更低的DNA转运噪音。单原子级厚度的Al2O3膜可用原子层沉积(ALD)法制造。在金属氧化物膜中制造纳米孔则是用聚焦离子束(FIB)和透射电子显微镜(TEM)技术。由于Al2O3带正电的表面与带负电的dsDNA分子之间的强静电相互作用，DNA通过Al2O3纳米孔的转运速度会比通过Si3N4纳米孔的转运速度慢。
2.2.3单层膜纳米孔
尽管以绝缘膜制造的固态纳米孔已广泛应用于检测DNA和蛋白质，但想要获得单碱基水平的分子结构信息，还有几个待解决的问题，如有限的空间和时间分辨率、毛孔阻塞和随机的DNA运动。提高空间分辨率的一种策略是使用超薄2D膜制造的纳米孔，膜的最小厚度(约0.335nm)和DNA链中两个碱基之间的距离(0.34nm)相近。石墨烯膜是具有卓越的电气性能和力学性能的单原子碳层，已被用作传统固态膜的替代品。其他2D材料，例如氮化硼(BN)和二硫化钼(MOS2)，也可以用于制作纳米孔。可以通过透射电子显微镜(TEM)用聚焦电子束(FEB)在悬浮的单层膜中制造纳米孔。单层膜纳米孔具有实现DNA测序的极高空间分辨率的潜力。
3 纳米孔的主要应用
纳米孔对分子的内部结构具有极高的分辨率，它已成为检测单分子相互作用的强大传感器。纳米孔广泛用于实时检测DNA⁃蛋白质相互作用，蛋白质⁃蛋白质相互作用和化学小分子。已经产生了基于纳米孔传感的一系列技术，用于疾病的早期检测和诊断以及重金属离子和病毒的检测。
3.1生物纳米孔的应用
大多数生物孔都有小通道，仅允许小分子通过，例如ss⁃DNA和ssRNA。α⁃HL纳米孔具有在平面磷脂双层中检测单个ssDNA和ssRNA分子的能力，这标志着单分子纳米孔DNA测序时代的开始。最近，有研究表明，具有共价健连接分子的α⁃HL可以通过测量纳米孔的电阻电流来连续识别未标记的单核苷酸(dAMP、dCMP、dGMP和dTMP)。工程化的α⁃HL跨膜蛋白孔已用作随机传感元件，用于鉴定和定量各种物质，包括阳离子、阴离子、癌症生物标记物、对映异构体、microRNA、肽和蛋白质。
除了α⁃HL纳米孔外，MspA纳米孔也可以检测ssDNA。实时DNA测序目前是一个主要挑战，在纵向电流下，由于膜的厚度(>10个碱基)不足和单个碱基的快速易位等因素而无法区分单个核苷酸。在2010年，有人就发现了MspA纳米孔具有很高的信噪比，可用于区分ssDNA的单个核苷酸，而双链DNA片段则可暂停易位。噬菌体phi29DNA包装马达具有最小直径为3.6nm的通道，可用于ssDNA、dsDNA和小蛋白的转运。修饰phi29连接蛋白，将其重组为脂质体并插入到平面脂质双层中时，具有亲水性区域的连接蛋白可以充当传导通道允许dsDNA易位。phi29蛋白通道转运dsDNA是单向性的，它仅允许dsDNA从N末端入口(较窄的末端)转移到C末端出口(较宽的末端)。
3.2固态纳米孔的应用
时间分辨率是基于固态纳米孔的DNA测序的一个重大挑战。理想的DNA移位速度为1bp(basepair)/ms，可以实现单核苷酸区分。DNA在生物纳米孔中的移位速度已经达到该值以下，而DNA易位通过固态纳米孔的速度比理想速度快2～4个数量级。
使用超薄2D膜中制造的纳米孔是提高空间分辨率的一种策略。据报道，使用MoS2纳米孔已成功降低了DNA与孔表面之间的相互作用。用2.8nmMoS2纳米孔进行了DNA均聚物易位，通过检测游离核苷酸成功实现了DNA均聚物的区分。除了DNA易位，纳米孔还可以用于DNA甲基化检测。Si3N4、石墨烯⁃Al2O3等固态纳米孔也已经被用于检测较大的分子，如蛋白质和蛋白质⁃DNA复合物。在2014年，Larkin等使用高带宽电流放大器、超薄HfO2和Si3N4膜纳米孔成功检测了蛋白酶K和RNA酶A，并测量了该蛋白的电迁移率、扩散常数和体积。
除了检测生物分子以外，固态纳米孔还被用于能量转换。基于纳米孔通道的能量转换方法充分利用了纳米级独特的物理化学性质。它转换环境中存在的清洁能源，例如将机械能转换为电能，将太阳能转化为电能，将盐度梯度能量转换为电能等。同时，它不会排放二氧化碳，不会产生对人体有害的振动和工作噪音，并且在转换过程中对环境非常友好。
4 展望
使用纳米孔技术对单个分子的检测已用于鉴定和定量各种分析物，是一项有前景的技术，对发展经济和提高生活质量亦具有重要意义。纳米孔单分子检测技术有可能成为无标记、快速且低成本的DNA测序技术，单碱基识别和减慢DNA位移速度仍然是主要的挑战。随着纳米技术的发展，纳米孔已应用于各个领域，特别是在DNA测序、蛋白质检测和能量转换中。随着先进的微纳米制造技术和新理论的发展，以更低的成本和更高的效率制造纳米孔将成为可能，其应用也将更加广泛。
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